作者：江苏省淡水水产研究所 郝忱，万金娟，沈美芳，薛晖，丁正峰，杨唯唯，史阳白
摘要:为了探讨中草药添加剂对克氏原螯虾生长、非特异性免疫力及抗白斑病综合征病毒感染的影响，选取600尾健康的克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，体质量为(7.70±0.07)g，随机分为4组，其中1组为对照组(D1)，投喂基础日粮，另外3组为试验组，分别在基础日粮中添加1.0%大黄(D2)、0.5%大黄+0.5%淫羊藿(D3)、0.3%大黄+0.3%淫羊藿+0.2%黄芪+0.2%板蓝根(D4)。连续投喂60d后，检测克氏原螯虾生长和血清相关免疫酶指标，并统计克氏原螯虾感染白斑病综合征病毒(WSSV)后的成活率，综合评价几种中草药添加剂对克氏原螯虾的作用效果。结果表明，与对照组相比，D4组显著提高了虾体增质量率和特定生长率(P＜0.05)；D3和D4组显著提高了铜蓝蛋白(CP)的含量(P＜0.05)；3个试验组虾血清中白蛋白(ALB)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)水平均显著提高，甘油三酯(TG)水平均显著降低(P＜0.05)；而3个试验组虾血清中总蛋白质(TP)、酸性磷酸酶(ACP)以及过氧化物酶(POD)水平差异不显著(P＞0.05)。中草药添加剂组能显著提高攻毒后虾的成活率(P＜0.05)，其中D4组效果最好。综上所述，在基础日粮中添加中草药复合添加剂(0.3%大黄+0.3%淫羊藿+0.2%黄芪+0.2%板蓝根)可以促进克氏原螯虾的生长，提高机体的非特异性免疫力以及抵抗白斑病综合征病毒的能力。
关键词:克氏原螯虾；中草药添加剂；生长；白斑病综合征病毒
克氏原螯虾(Procambarusclarkii)俗称小龙虾，隶属甲壳纲(Cmstacea)十足目(Decapoda)螯虾科(Cambaridae)原螯虾属(Procambarus)，因其肉质鲜美、营养丰富受到消费者青睐，是当今世界上最主要的淡水螯虾养殖种类，其产量占整个螯虾产量的70%～80%，也是中国目前重要的经济水产养殖对象。近年来，克氏原螯虾养殖规模逐年扩大，据统计，仅湖北省荆州地区养殖克氏原螯虾的水面就已经达到数万公顷。但随着人工养殖面积的迅速扩大，病害的发生也越来越频繁和严重。国内已相继报道了克氏原螯虾的螺原体病、烂鳃病等疾病，其中白斑综合征病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)为一种无包涵体病毒，地理分布广，流行范围大，传染性强，目前尚无有效治疗途径。近几年以来，白斑综合征病毒在克氏原螯虾养殖中开始流行，并成为克氏原螯虾养殖中的重要病害，给养殖业带来巨大损失。
传统上治疗和预防克氏原螯虾疾病主要依赖抗生素、化学药物等，但这些药物滥用容易造成环境污染、药物残留、病原微生物的耐药性、免疫抑制和破坏机体微生态平衡等诸多负面影响，严重困扰着克氏原螯虾的养殖。因此，提高动物自身的免疫力对解决养殖病害问题极为重要。天然中草药取自于天然动植物产品，保持了其成分、结构的自然状态和生物活性，作为饲料添加剂，不仅有补充营养、促进生长、增强体质、提高抗病力的作用，与化学添加药剂相比，还具有低毒、低残留、耐药性不显著等特点。因此中草药添加剂已日益成为替代抗生素和化学合成药物的新一代添加剂。大黄、淫羊藿、黄芪和板蓝根是中国传统中药材，具有抗病毒、抗氧化、调节机体体液免疫、激活免疫因子等功效，但其尚存在单一使用的不足之处。目前已有一些关于大黄、淫羊藿、黄芪以及板蓝根在水产养殖中少量使用的报道，但有关大黄、淫羊藿、黄芪和板蓝根的配伍使用及其对克氏原螯虾的影响还未见报道。因此，通过对克氏原螯虾血清的测定及感染WSSV后死亡情况的研究，筛选促进生长和调节克氏原螯虾非特异性免疫功能的中草药免疫调节剂，可进一步为克氏原螯虾免疫应答机理研究和提高其抗病能力提供科学依据，对克氏原螯虾健康养殖和可持续发展具有重要意义。
1材料与方法
1．1试验虾、中草药添加剂及日粮
克氏原螯虾由江苏省淡水水产研究所禄口基地提供。选择健康、质量基本一致的虾600尾，初始体质量(7.70±0.07)g。随机分为4组，分别为对照组D1(投喂基础日粮)、试验组D2(基础日粮添加1.0%大黄)、试验组D3(基础日粮添加0.5%大黄+0.5%淫羊藿)和试验组D4(基础日粮添加0.3%大黄+0.3%淫羊藿+0.2%黄芪+0.2%板蓝根)，每组设3个重复，共12个水泥池(规格为2.5m×2.5m×0.8m)，每池放养50尾试验虾。大黄、淫羊藿、黄芪和板蓝根购自安徽省亳州药材市场，先粗粉碎，再经超微粉碎机粉碎，过120目筛网，混合机内充分混匀备用。各种饲料原料分别粉碎，充分混匀后，用SLP-45型膨化机(中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所产品)制成粒径2.0mm的沉性颗粒饲料，50℃烘干后于4℃冰柜中保存备用。基础日粮组成及主要营养成分见表1。
1．2饲养管理
克氏原螯虾在江苏省淡水水产研究所禄口基地水泥池驯化7d后投喂试验日粮，每天投喂3次(8∶00、16∶00、22∶00)。日投饵量为虾体质量的4%～6%，上午投饵量为日投饵量的30%，下午为30%，晚上为40%，并根据摄食、生长情况作适当调整。水泥池采用循环流水系统，饲养期间水温27～32℃左右，pH为7．3～7.8，溶解氧大于6mg/L，氨氮小于0.01mg/L，硫化氢小于0.01mg/L。减少人为干扰，保持安静，防止额外应激，每日观察虾摄食及死亡情况，发现死虾及时捞出称质量记数，并检查死亡原因。正式养殖60d后结束，进行称质量和采样等。
表1试验饲料配方及营养组成
1)复合预混料:1kg饲料含维生素E150.00mg、维生素K50.00mg、维生素B180.00mg、维生素B250.00mg、烟酸150.00mg、泛酸150.00mg、维生素B650.00mg、生物素1.00mg、维生素B120.02mg、叶酸10.00mg、维生素C300IU、维生素A10000IU、维生素D2000IU、硫酸铜2.00g、硫酸铁25.00g、硫酸锌22.00g、硫酸锰7.00g、亚硒酸钠0.04g、碘化钾26.00mg、氯化钴0.10g。
1．3采样与处理
60d饲养试验结束后，禁食24h，将各池虾称质量计数。每池随机选取10尾虾，用1ml的一次性注射器从虾的头胸甲后部刺入心脏，抽取血液，并置于4℃冰箱中过夜；以4℃5000r/min离心10min，取上清液作为待测血清，－20℃冻存备用。
1．4攻毒试验
采样结束后，从各水泥池剩余的虾中再选取体质量基本一致的克氏原螯虾进行攻毒试验，每个池取30尾虾。采用江苏省淡水水产研究所提供的白斑综合征病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)，按照Mai等所述方法制备WSSV病毒液，每尾虾肌肉注射病毒液0.1ml。然后分别放养于室内养殖箱(规格为1.0m×0.4m×0.4m)中，保证充足的溶氧。观察注射WSSV病毒后的虾生理活动和死亡情况，并分别于0h、12h、24h、36h、48h、60h统计成活率。
1．5测定指标与方法
1．5．1生长指标分别按下列公式计算增质量率(WG)、特定生长率(SGR)、饵料系数(FCR)、成活率(SR):增质量率(WG)=100×(Wt－W0)/W0，特定生长率(SGR)=100×(LnWt－LnW0)/t，饵料系数(FCR)=FI/(Wt－W0)，成活率(SR)=100×Nt/N0，式中W0为鱼初体均质量，Wt为鱼末体均
质量，t为饲喂天数，FI每尾鱼平均摄食饲料总量(风干样质量)，N0为试验开始时尾数，Nt为试验结束时尾数。
1．5．2血液指标选用白蛋白(ALB)、铜蓝蛋白(CP)、总蛋白质(TP)、一氧化氮(NO)和甘油三酯(TG)含量，以及酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、总超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性作为非特异性免疫指标。ALB、CP、TP、NO和TG含量以及ACP、LZM、SOD和POD的活性采用相关试剂盒进行测定，试剂盒均购自南京建成生物研究所。
1．6数据统计与分析
试验数据用SPSS16．0统计软件包中的单因素方差分析(One-wayANOVA)和Duncan氏多重比较，检验各组间的差异。
2结果与分析
2．1中草药添加剂对克氏原螯虾生长性能的影响
从表2可见，与对照组相比，D4组克氏原螯虾的增质量率和特定生长率均显著提高(P＜0.05)，其中增质量率提高了27.58%，特定生长率提高了15.30%。各组间饵料系数和成活率无显著差异(P＞0.05)。
2.2中草药添加剂对克氏原螯虾血液生理生化指标的影响
与对照组相比，D2、D3和D4组虾血清白蛋白的水平均显著增加(P＜0.05)(表3)，分别增加了31.40%、49.00%和42.43%；D3和D4组虾血清铜蓝蛋白含量较对照组显著提高了28.17%和27.38%(P＜0.05)。3个试验组虾血清甘油三酯的水平均显著低于对照组(P＜0.05)。各组间总蛋白质含量没有显著差异(P＞0.05)。
表2中草药添加剂对克氏原螯虾生长性能的影响
D1(对照):投喂基础日粮；D2:在基础日粮中添加1.0%大黄；D3:在基础日粮中添加0.5%大黄+0.5%淫羊藿；D4:在基础日粮中添加0.3%大黄+0.3%淫羊藿+0.2%黄芪+0.2%板蓝根。同一列中不同小写字母表示组间差异显著(P＜0.05)。
表3中草药添加剂对克氏原螯虾血液生理生化指标的影响
各处理见表2注。同一列中不同小写字母表示组间差异显著(P＜0．05)。
2．3中草药添加剂对克氏原螯虾相关免疫酶活性的影响
从图1可见，与对照组相比，3个试验组虾血清溶菌酶、超氧化物歧化酶水平均显著提高(P＜0.05)，其中溶菌酶水平分别提高了92.67%(D2)、86.50%(D3)、96.36%(D4)，超氧化物歧化酶水平则分别提高了25.91%(D2)、14.29%(D3)、38.32%(D4)。此外，3种中草药添加剂对虾血清酸性磷酸酶和过氧化物酶水平的影响不大(P＞0.05)。
各处理见表2注。
图1中草药添加剂对克氏原螯虾相关免疫酶活性的影响
2．4中草药添加剂对克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的影响
克氏原螯虾人工注射感染WSSV后，D4组虾的成活率在48h时显著高于对照组，3个试验组虾的成活率在60h均显著高于对照组(P＜0.05)，其中D4组效果最好，成活率分别比对照组提高了18.75%(48h时)、70.00%(60h时)(图2)。各试验组间差异不显著(P＞0.05)。
D1～D4处理见表2注。
图2中草药添加剂对克氏原螯虾感染白斑综合征病毒后成活率的影响
3讨论
中草药具有天然、高效、毒副作用少、资源丰富等优点，含有多种生物活性物质和天然营养物质，例如多糖、生物碱、蒽醌类、黄酮类化合物和葡萄糖氨基酸等，能促进动物的机体代谢和蛋白质以及酶的合成，提高营养物质的利用率，提高免疫力、成活率并促进养殖动物的生长。已有研究结果表明复方中草药制剂对鱼类和对虾具有促生长作用，王芸等报道，将大黄、黄芩、甘草和黄芪等比例组成的复方制剂投喂凡纳滨对虾后，其增质量率显著高于对照组；丁贤等报道由板蓝根、大叶青、黄芪等组成的复方中草药可以显著提高虾肠道消化酶的活性，从而利于养分的消化，促进生长。本研究结果亦表明:由大黄、淫羊藿、黄芪和板蓝根等组成的复方制剂，可以明显促进克氏原螯虾的生长，这与上述报道结果类似。推测其机理可能是，一方面，黄芪、淫羊藿、黄芪和板蓝根含有黄酮类化合物、黄芪多糖、葡萄糖氨基酸以及铁、锌、硒等微量元素，这些都是动物生长代谢所必需的营养成分；另一方面，大黄、淫羊藿、黄芪等可以通过调节对虾肠道消化酶和肠道菌群的组成而促进对饲料中营养成分的消化和吸收。但是大黄单一添加以及大黄与淫羊藿的配伍组合并未显著提高克氏原螯虾的增质量率，这与Xie等、Zhang等、Liu等的研究结果不一致，这可能是由于他们在试验中所用的是中草药提取物及其添加量不同导致的，具体原因还有待进一步的研究。
水产动物血液与机体的代谢、营养状况以及疾病等有着密切的关系，当其受到外界因子的影响而发生生理变化时，必然会在血清指标中反映出来。因此，血清成分的变化被广泛地用来评价水产动物的营养状况和健康状况，是重要的生理生化指标。血清中蛋白质含量反应了机体的营养和代谢状况，Ming等在研究中指出，饲料中添加大黄能显著提高团头鲂血清中总蛋白质含量；陆鑫等指出，复方中草药能显著提高尖吻鲈血清总蛋白质含量；王吉桥等也有类似研究。本试验中，在基础饲料中添加中草药添加剂未能显著提高血清总蛋白质含量，但白蛋白和铜蓝蛋白的水平均显著提高。本试验还发现，中草药添加剂的使用能显著降低血清甘油三酯含量，这与明建华等关于大黄的研究结果是一致的。
另一方面，克氏原螯虾等甲壳动物自身的防御机能主要依赖于自身的非特异性免疫系统，它包括天然形成或诱导产生的各种因子，以及各种具有免疫活性的酶类。酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶以及过氧化物酶等是生物体中重要的酶类，参与多种生理代谢反应，在异己物质的识别和免疫防御方面起重要作用，因此被作为健康评价的指标。其中超氧化物歧化酶是机体快速有效清除活性氧的重要抗氧化酶，是生物体防御氧化损伤的重要酶类，并被证明在多种十足类甲壳动物中具有免疫调节作用；此外，溶菌酶作为非特异性免疫的第一道屏障，有抗感染、增强抗生素效力、抗肿瘤和抗病毒等作用。中草药中一些成分如多糖类化合物、免疫多糖等具有提高虾类免疫功能的作用。本研究结果表明，在饲料中添加由大黄、淫羊藿、黄芪和板蓝根组成的中草药饲料添加剂，克氏原螯虾血清中的超氧化物歧化酶和溶菌酶活性显著增高，可以认为本试验中所用复合中草药添加剂可以通过提高水产动物血液中超氧化物歧化酶活性，减少自由基对于正常细胞的损伤；同时中草药中的多糖及苷类化合物激活机体的溶菌酶活性。张耀武等采用黄芩、茯苓、板蓝根、黄芪、大黄、甘草等7余味中草药制成复方添加剂，按照一定比例添加于基础饲料中并投喂罗氏沼虾，结果表明罗氏沼虾血清溶菌酶活力显著提高，说明中草药添加剂可以提高罗氏沼虾的非特异性免疫机能。这也与Qiao等、王芸等、Yin等和Jian等有关复合中草药添加剂对凡纳滨对虾、罗非鱼和建鲤机体超氧化物歧化酶、溶菌酶影响的研究结果是基本一致的。
本试验中，克氏原螯虾经注射WSSV后，中草药添加剂组克氏原螯虾的成活率显著高于对照组(P＜0.05)，4种中草药复合添加剂组效果尤其明显，这可能是由于本研究中大黄、淫羊藿、黄芪和板蓝根这4种中草药的组合，一是很好地利用了大黄与黄芪的“相使关系”；二是大黄、淫羊藿和黄芪皆具有调节免疫和抗炎活性，可双向调节免疫应答、炎症反应过程中各种因子的产生；三是以黄芪补中益气，淫羊藿调节免疫以扶，板蓝根清热解毒以祛邪，三药合用，共奏扶正祛邪、清热解毒之功。这与以前的一些研究报道是一致的，如Ardo等在饲料中添加黄芪和金银花提取物可降低试验鱼攻毒后的死亡率，增强机体的抗病力；温周瑞等也有类似报道。此外，Yin等也指出复合中草药添加剂对鲤鱼的抗菌效果比单一中草药添加剂要好，说明药物之间具有协同作用。
综上所述，在基础日粮中添加中草药复合添加剂(0．3%大黄+0．3%淫羊藿+0．2%黄芪+0．2%板蓝根)可以促进克氏原螯虾的生长，提高机体的非特异性免疫力以及抵抗白斑病综合征病毒的能力。
