猪流感病毒H1N1分离株HA基因的克隆与序列分析

猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道感染病。流感病毒属于正黏病毒科，包括A、B、C、托高土病毒属4个属。A型流感病毒可以传染多种动物，包括很多禽类和哺乳动物。B型和C型病毒似乎只能从人体内分散到，虽然也从猪体内分散到了C型流感病毒[1]，但传染猪的首要照旧A型流感病毒。早在1918年，美国、匈牙利和中国就有关于猪流感的报道，这与1918年西班牙人类大流感的时间一致。今朝该病呈世界漫衍，但首要以处所性风行为主。纯粹的SIV传染体现为发病率高(100%)。病死率低(约5%)的特点，其严重水平与风行毒株、猪的日龄和康健状态、情况前提及细菌性继发传染相干。猪流感不仅危害猪体康健，同时影响育肥猪的上市时间，并增长豢养成本，对养猪业造成的丧失不容忽视。<?XML:NAMESPACE PREFIX = O />

猪流感病毒不仅对猪体康健和养猪业危害大，在整个流感病毒的遗传进化和生态漫衍中都占据紧张职位，出格是对人类康健具有潜在的威胁。虽然比年来产生了多起禽流感病毒传染人并引致疾病以致灭亡的事例[2]，但一般认为流感病毒具有种属特异性，即禽流感病毒很难冲破种间屏蔽直接传染人[3­4]。2006年底，无锡某猪场产生差别水平的呼吸体系疾病，本研究对从该猪场分散的一株具有血凝特征的毒株H1N1，操纵RT­PCR扩增HA基因。经遗传阐明表白，该分散株属古典型H1N1，极可能在人­畜­禽间彼此流传。

1　质料与要领

1.1 　质料

新城疫病毒La Sota株、禽流感病毒H9N2、猪流感病毒H3N2、人源流感病毒PR8株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠。A/Swine/Wuxi/1/07(H1N1)病毒株分散于江苏无锡地域某发病猪场鼻拭子样品；SPF鸡胚(9日龄)购自山东SPF鸡胚孵化场。

1.2　载体与首要试剂

pGEM­T easy载体、T4 DNA毗连酶、RT­PCR试剂盒购于美国Promega公司；凝胶回收DNA试剂盒购于德国QIAGEN公司；EcoRⅠ酶购自MBI公司。

1.3　HA基因的扩增

1.3.1　病毒RNA提取　通过SPF鸡胚扩增上述病毒，网络尿囊液，经浓缩后接纳Trizol试剂提取各病毒RNA。吸取250 μL病毒液至1.5 mL用DEPC水处置惩罚过的Eppendorf管中，插手750 μL Trizol试剂，混匀后置15 ℃～30 ℃感化5min；插手0.2 mL的氯仿，用手剧烈摇15 s，室温静置5 min；于4 ℃ 以12 000 r/min离心15 min；取上清于另一个Eppendorf管中，插手500 μL的异丙醇，室温感化10 min，于4 ℃以12 000 r/min离心10 min；弃上清，插手750 mL/L的乙醇1 mL漂洗2次；干燥后用DEPC水重悬，－20 ℃生存备用。

1.3.2　分散株亚型判定　别离接纳Choi等成立的判别H1和H3亚型的RT­PCR法对分散株举行亚型判定。判别H1和H3亚型的两套引物序列为：HF1：5′­GGGACATGTTACCCAGGAGAT­3′，HR1：5′­GCATTGTATGTCC AAATATCCA ­3′，HF3：5′­TATGCCTGGTTTTCGCTCAA­3′，HR3；5′­TTCGGGATTACAGTTTGT TG­3′。第一套引物扩增片断长度为1 006 bp，为H1亚型特异性；第二套引物扩增片断长度为663 bp，为H3亚型特异性。PCR反映参数为：94 ℃ 50 s，54  ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s,30个轮回；72 ℃延伸10 min，4 ℃生存。

1.3.3　HA的引物设计　按照已颁发的猪流感H1N1 HA序列设计上游引物P1：ATG AAA GCA AAA CTC CTG ATC CTG T；下游引物P2：CAG ATG CAT ATT CTA CAC TGC AAA，以尿囊液提取的RNA为模板扩增HA基因。

1.3.4　HA全基因片断的RT­PCR　按Promega

公司的AMV RT­PCR试剂盒操作申明书举行，反映体积为25 μL。反映混淆物包括RNA模板5 μL，上下游引物各0.1 μmol/L，AMV逆转录酶2.5 U，Taq DNA聚合酶2.5 U，RNA酶抑制剂20 U，dNTP混淆物1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L。举行反映时，起首逆转录反映50 ℃ 30 min，然后94 ℃ 2 min，使逆转录酶失活，再举行通例PCR。

1.4　重组质粒的构建及判定

PCR产品经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，别离操纵QIAGEN公司凝胶回收试剂盒回收，与pGEM­T easy载体按1∶8(摩尔比)于4 ℃毗连12 h，转化DH5α，用AIX(含有0.1 mg/mL Amp， 0.1 mg/mL IPTG，0.02 mL X­gal)LB平板蓝白斑筛选，提取白斑的质粒DNA，用Eco RⅠ酶切判定，筛选阳性克隆。

1.5　序列阐明

通过DNA Star软件和BlastN软件阐明HA基因的遗传特征，阐明该分散株的遗传配景和来历。

2　成果

2.1　HA基因RT­PCR扩增成果

通过RT­PCR要领的扩增成果可见，该病毒为H1亚型流感病毒，操纵H3的特异性引物不能扩增得到HA，而通过H1特异的引物举行扩增，则可见1.7 kb的阳性条带，将该片断克隆入T载体中，用EcoRⅠ单酶切，将阳性的克隆测序。成果显示，该场分散的病毒为H1N1分散株(图1)。

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1.T­HA酶切判定成果；2.DNA尺度10 000

1.T­HA digested by EcoRⅠ；2.DNA Marker 10 000

图1　HA基因克隆入T载体

Fig.1　Subcloning of HA gene into  pGEM­T easy vector 

2.2　遗传进化阐明

通过RT­PCR扩增H1N1 HA基因，将其克隆入T载体，经测序判定，与GenBank中其他分散毒株举行比力，发明该分散株为人型H1N1，与古典H1N1 PR8毒株同源性最高(图2)。 

图2　体系进化树阐明

Fig.2　Analysis of the phylogenetic tree

3　接头

世界各地风行的SIV包括3种首要的亚型，即H1N1、H3N2和H1N2亚型，个中包括差别的基因型，即古典猪H1N1、类禽H1N1、类人H3N2、基因重配的H3N2以及多基因型的H1N2亚型。别的，H1N7、H4N6、H9N2、H5N1和H3N3等亚型病毒也从猪体内分散到，但都未在猪群中引起流传。我国比年来不停有SIV分散的报道，但SIV在我国的风行环境仍旧不清晰[5­7]。

通过对猪体内分散到的H1N1流感病毒的HA举行进化树阐明，表白古典型H1N1 SIV，与类人H3N2流感病毒一样，持久存在于我国猪群中。早在1976到1982年，中国南边猪群中SIV监测发明，古典H1N1 SIV和类人H3N2病毒配合存在。郭元吉等[8­9]从北京某猪群中分散到古典猪H1N1病毒，这是在中国大陆的初次报道。Guan Y等[10]在中国猪群中发明了类禽H1N1病毒，但没有造成风行。本研究从无锡市猪群中分散到1株SIV，进一步证明人型H1N1亚型流感存在于猪群中，表白我国猪群中的流感病毒有传染人类的可能性。因此，在猪群中，火急需要成立持久有用的监测。

猪被认为是禽、人流感病毒的中心宿主和基因混淆器。猪因为呼吸道上皮同时具有2种类型的流感病毒受体[4]，因此人和禽流感病毒都可以传染猪，这就为禽流感病毒传染人提供了两种可能。其一，禽流感病毒在猪体顺应后得到了传染人的能力；其二，这为禽流感病毒与人流感病毒产生基因重配提供了时机，这种含有禽流感病毒基因的重配病毒可能传染人并引起风行。别的，猪也可能成为人流感病毒(H1N1和H3N2亚型)的贮存宿主，一些人流感病毒亚型在人群中消散后，可以在猪群中连续存在，成为人流感的潜在感染源[5]。以是猪流感也是一种值得器重的人兽共患病。

比年来，猪呼吸道疾病在我国很多处所猪场频仍产生，症状与外洋风行的呼吸道疾病(porcine respiratory disease complex， PRDC)相似，病原较为庞大。在对SIV的研究中，很多流感病毒是从外观康健的猪体内分散到的[5,10]，SIV一旦传染猪群就很难革除，SIV可以在猪群中连续存在[5]。本研究收罗的样品来自患病猪群，在SIV分散阳性的猪群中可能还存在其他病原的混淆传染，如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV­2)等。而我外洋观康健猪群中的SIV风行环境若何，则有待进一步研究。